PRAKTIKUM SPEKTROFOTOKOPI UNTUK PENENTUAN KADAR PROTEIN

SPEKTROFOTOKOPI UNTUK PENENTUAN KADAR PROTEIN

A. Pendahuluan

     1.  Latar Belakang

Secara sederhana, definisi dari spektrofotometri adalah pengukuran penyerapan energi cahaya suatu sistem kimia sebagai fungsi dari panjang gelombang dan radiasi. Dalam percobaan, metode ini biasanya digunakan untuk menentukan kadar Fe³⁺ dalam sampel. Alat yang digunakan adalah spektrofotometer UV/Vis yang merupakan sebuah instrumen untuk mengukur transmitansi atau absorbansi suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang (UV: 185–400 nm; Vis: 400–760 nm).

Beberapa istilah yang sering dipakai dalam spektrofotometer adalah absorbansi, transmitan, kuvet, drive cell, dan blangko. Absorbansi adalah daya radiasi sinar yang diserap oleh larutan baik itu larutan baku maupun blangko, sedangkan transmitan adalah daya radiasi sinar yang diteruskan atau yang keluar dari kuvet dan daya radiasi sinar yang masuk ke dalam kuvet. Kuvet adalah tempat untuk meletakkan larutan, baik larutan blangko maupun larutan baku, sedangkan Drive cell adalah tempat untuk meletakkan kuvet. Keberadaan blangko berfungsi untuk mengoreksi adanya sinar yang dipantulkan oleh kuvet dan sinar yang diserap oleh substituen lain.

               Jika cahaya (radiasi elektromaknetik mengenai suatu bahan maka sebagian energinya akan diserap oleh molekul bahan sehingga elektro-elektronya menjadi teroksitasi ketingkat yang lebih tinggi. Besar perbedaan tingkat energi ground state dengan tingkat energi tereksitasi untuk setiap molekul tidak sama. Maka dari itu, panjang gelombang optimum yang dimiliki bahan yaitu panjang gelombang dimana energi yang dimiliki gelombang itu besarnya sama dengan yang dibutukan untuk mengeksitesi electron-elektron bahan. Jumlah energi yang diserap sebanding dengan jumlah materi bahan, sehingga spektrofotokopi dapat digunakan untuk uji yang bersifat kuantitatif.

2.  Tujuan Praktikum

Praktikum acara II  Spektrofotokopi untuk Penentuan Kadar Protein ini bertujuan untuk menentukan kadar protein dengan bantuan spektrofotometer.

3. Waktu dan Tempat Praktikum

Praktikum acara II ini dilaksanakan pada hari Rabu tanggal 20 November 2012 pada pukul 07.00 – 10.00 WIB di Laboratorium Biologi Tanah Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta.

B.  Tinjauan Puataka

Protein merupakan makromolekul  polipeptida yang tersusun dari sejumlah asam-asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptide dan mempunyai bobot molekul 5000 sampai berjuta-juta. Satu molekul protein disusun oleh sejumlah asam amino tertentu dengan susunan tertentu pula dan bersifat turunan (Aisyah, 1999).

Protein pada setiap bahan kadarnya berbeda-beda. Pengukuran kadar protein suatu bahan sangat diperlukan karena erat kaitannya dengan tingkat konsumsi manusia. Pengukuran kadar protein dengan menggunakan metode Lowry adalah dasar dari penggunaan spektrofotometer. Metode ini dapat mengukur kadar protein sampai dengan 5 mikrogam. Warna biru yang terjadi oleh pereaksi Ciocalteau disebabkan reaksi antara protein dan Cu dalam larutan alkalis dan terjasi reaksi garam fosfomoliddat oleh tirosin dan triptopan (Ahmad, 1999).

Konsentrasi protein diukur berdasarkan atas optical dencity pada panjang gelombang tertentu untuk mengetahui banyaknya protein dalam larutan. Protein dengan garam fosfotungstat pada suasana alkalis akan memberikan warna biru yang intensitasnya tergantung pada konentrasi protein terteta (Arthur, 2001).

Kurva standart merupakan kurva alibrasi dari sederet larutan standart larutan-larutan itu. Larutan itu sebaiknya mempunyai komposisi cuplikan. Hasil tidak pernah didasarkan pada literature absortivitas molar. (Polling, 1999).

Analisa Kedelai dapat dipakai untuk menganalisis kadar protein dalam bahan makanan secara tidak langsung. Analisa ini dipakai untuk mengetahui kadar protein dengan menggunakan asam sulfat pekat dengan katalis selenium oksiklorida. Cara ini merupakan cara yang sederhana dan mudah dilakukan (Basari, 1999).

C. Alat, Bahan dan Cara Kerja

     1. Alat

         a. Tabung Reaksi

               b. Rak Tabung reaksi

               c. Pipet

               d. Gelas Ukur

               e. Pengaduk

               f. Spektrofotometer

               g. Stopwatch

           2. Bahan

               a. Larutan standart BSA

               b. Susu

               c. Kedelai

               d. Reagen D

               e. Reagen E

               f. Akuades

  3. Cara Kerja

a.       Memasukkan 1 ml sampel (larutan BSA) dan 2 ml sampel kedelai ke dalam tabung  reaksi yang berbeda sesuai dengan konsentrasi yang ditentukan, tambahkan 1 ml reagen D dan gojog pada suhu ruangan dan diamkan selama 15 menit.

b.      Menambahkan reagen E dan gojog segera, dan biarkan selama 45 menit. ukur absorbansinya pada 540 nm

D. Hasil dan Analisis Pengamatan

          1. Hasil Pengamatan

              Tabel 1.1 Pengukuran absorbansi larutan standart BSA

Y (Absorbansi)	X (Konsentrasi)
0	0
0,055	0,2
0,097	0,4
0,131	0,6
0,177	0,8
0,219	1

         Sumber : Laporan Sementara

         Tabel 1.2 Pengukuran absorbansi sampel

Sampel	Y (Absorbansi)
Susu	0,203
Kedelai	0,119

         Sumber : Laporan Sementara

      2. Analisis Hasil Pengamatan

           a. Pengukuran Absorbansi Larutan BSA

               a = 0,028 ,b = 4,665 ,r = 0,996

               y           =  a + b x    

               0           =  0, 028 + 4,665 x

              -4,665x  =  0, 028

              x            =   

                            = -0,006

               Kadar sampel       =   x 100%

                                             =   x 100

                                              =  0,12%          

b. Penentuan besarnya konsentrasi sampel

                Y = a + bx  →  Y = 0,028 + 4,665 x

   Sampel Susu

                Y                            =  a + b x

    0,203                      =  0, 028 + 4,665 x

                0,203-0,028            =  4,665x

                x                             =

                                               = 0,0375134

               Sampel Kedelai

               Y                             = a + bx

                      0,119                = 0,0465 + 4,665x

                       0,091               = 4,665x

                          x                   =

                                               = 0,0195

 c.  Penentuan besarnya kadar protein pada masing-masing sampel :

               Sampel Susu

               Kadar protein = 

                                      =  

                                         = 0,75%

               Sampel Kedelai

               Kadar protein = 

                                      =

                                      = 0,39%

                                 Gambar Grafik

              0,203

                

             0,119 -

            

 

                       0                   

                                         0,02                  0,04                     x

                            Gambar 2.1 Grafik Susu dan Kedelai

E.  Pembahasan dan Kesimpulan

          1. Pembahasan

 Spektrofotometer adalah alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer. Spektrofotometer merupakan salah satu alat yang dapat digunakan untuk mengukur absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu. Berfungsi untuk menentukan kadar protein pada suatu bahan atau sampel. Prinsip kerjanya yaitu reaksi antar radiasi elektromagnetik dengan partikel bahan

Spektrofotokopi adalah cara analisis kimia yang populer. Yaitu spektrofotometer UV-VIS yang berprinsip kerja reaksi antara radiasi elektromagnetik dengan partikel bahan. Radiasi elektromagnetik berfungsi sebagai gelombang dan sebagai materi. Sebagai gelombang, yang radiasi elektromagnetiknya mempunyai panjang gelombang tertentu yang membuatnya dapat memberikan warna yang terlihat yaitu warna pelangi. Sebagai materi, gelombang elektromagnetik mempunyai energi yang dapat berinteraksi dengan partikel bahan. Jadi radiasi elektromagnetik adalah suatu gelombang elektromagnetik yang dapat mengahasilkan warna pelangi dan mempunyai energi yang dapat berinteraksi dengan sampel atau bahan.

            Penentuan kadar protei menggunakan metode lowry Folin Ciocalteu, menggunakan prinsip pereaksi Folin Ciocalteu yang berwarna biru disebabkan reaksi antara protein Cu2+ dengan larutan alkalis dan terjadi reduksi garam fosfofungsilat fosfomolibat oleh tirosin dan tripiopan yang ada dalam protein. Untuk mengukur banyaknya protein dalam suatu bahan atau larutan maka diperlukan kurva standar yang menggambarkan hubungan antara konsentrasi dengan absorbansi pada panjang gelombang 540 nm.

2. Kesimpulan

Berdasarkan praktikum spektrofotokopi untuk penentuan kadar protein dapat diambil kesimpulan sebagai berikut :

a.       Pada konsentrasi BSA diperoleh persamaan garis regresi Y = 0,028 + 4,665X

b.      Kadar protein tertinggi dari percobaan adalah kadar protein dari susu 0,75%

c.       Pembuatan kurva standar dari larutan standar juga digunakan untuk menentukan kadar protein sampel

d.      Garis absorbansi larutan BSA dengan garis absorbansi sampel berbanding lurus.

e.       Nilai absorbansi sampel susu lebh besar dari sampel kedele

                         

DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, 1997, Kimia Dasar, Prinsip, dan Terapan Modern. Jakarta. Erlangga.

Aisyah, 1998. Kimia Untuk Universitas. Gramedia. Jakarta

Arthur, 1996. Kimia Anorganik. Erlangga. Jakarta.

Basari, 1997.  Kimia Dasar. PT. Gunung Muria. Kudus.

Polling, 1996. Panduan Prantikum. CV. Manggala Offset. Bandung.